微生物限度檢測原理和應(yīng)用范圍

微生物的檢測，無論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意義，本文對生長量測定法、微生物計數(shù)法、生理指標(biāo)法和商業(yè)化快速微生物檢測簡要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標(biāo)的二十余種常用的檢測方法，簡要介紹了這些方法的原理，應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。
　　一個微生物細(xì)胞在合適的外界條件下，不斷的吸收營養(yǎng)物質(zhì)，并按自己的代謝方式進(jìn)行新陳代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用，則其原生質(zhì)的總量（重量，體積，大?。┚筒粩嘣黾?，于是出現(xiàn)了個體的生長現(xiàn)象。如果這是一種平衡生長，即各細(xì)胞組分是按恰當(dāng)?shù)谋壤鲩L時，則達(dá)到程度后就會發(fā)生繁殖，從而引起個體數(shù)目的增加，這時，原有的個體已經(jīng)發(fā)展成一個群體。隨著群體中各個個體的進(jìn)一步生長，就引起了這一群體的生長，這可從其體積、重量、密度或濃度作指標(biāo)來衡量。微生物的生長不同于其他生物的生長，微生物的個體生長在科研上有困難，通常情況下也沒有實(shí)際意義。微生物是以量取勝的，因此，微生物的生長通常指群體的擴(kuò)增。微生物的生長繁殖是其在內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映。因此生長繁殖情況就可作為研究各種生理生化和遺傳等問題的重要指標(biāo)，同時，微生物在生產(chǎn)實(shí)踐上的各種應(yīng)用或是對致病，霉腐微生物的防治都和他們的生長抑制緊密相關(guān)。所以有必要介紹一下微生物生長情況的檢測方法。既然生長意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù)，而測定繁殖則都要建立在計數(shù)這一基礎(chǔ)上。微生物生長的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標(biāo)來進(jìn)行衡量。
　　1. 微生物計量法
　　1.1 體積測量法
　　又稱測菌絲濃度法，通過測定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取量的待測培養(yǎng)液（如10 mL）放在有刻度的離心管中，設(shè)定的離心時間（如5 min）和轉(zhuǎn)速（如5000 rpm），離心后，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個重要監(jiān)測指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設(shè)定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物，結(jié)果會有偏差。
　　稱干重法
　　可用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10~20%。在離心法中，將體積待測培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定的離心時間和轉(zhuǎn)速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌1~5次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾后用少量水洗滌，在40 ℃下進(jìn)行真空干燥。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母（Activity Dry Yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。
　　1.3 比濁法
　　微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長作定時跟蹤時，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測。如使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600 nm處用比色管定時測定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監(jiān)控E.coli的生長及誘導(dǎo)時間。
　　1.4 菌絲長度測量法
　　對于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測定時間內(nèi)菌絲生長的長度，或是利用一只一端開口并帶有刻度的細(xì)玻璃管，到入合適的培養(yǎng)基，臥放，在開口的一端接種微生物，一段時間后記錄其菌絲生長長度，借此衡量絲狀微生物的生長。
　　2. 微生物計數(shù)法
　　2.1 血球計數(shù)板法
　　血球計數(shù)板是一種有結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平臺，兩嵴的表比兩平臺的表面高0.1 mm，每個平臺上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1 mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統(tǒng)計大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算出1 mL菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。
　　2.2 染色計數(shù)法
　　為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計數(shù)，而直接用血球計數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計數(shù)法。借助不同的染料對菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧梢愿奖愕脑陲@微鏡下進(jìn)行活菌計數(shù)。如酵母活細(xì)胞計數(shù)可用美藍(lán)染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無色，而死細(xì)胞為藍(lán)色。
　　2.3 比例計數(shù)法
　　將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測細(xì)胞濃度的菌液按比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.4 液體稀釋法
　　對未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計數(shù)，從適宜的三個連續(xù)的10倍稀釋液中各取5 mL試樣，接種1 mL到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查大或然數(shù)表MPN（Most Probable Number）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物*。